Grande scoperta, biopsia liquida carcinoma video Dottor Salute 

Grande scoperta, biopsia liquida carcinoma video Dottor Salute Presso la Sezione di Chirurgia Oncologica della Mammella e dei Tessuti Molli dell’Università di Perugia, in collaborazione con il Laboratorio del Dipartimento di Medicina Sperimentale dell’Università di Perugia ed il Laboratorio di Biologia Molecolare della S.C. di Oncologia Medica dell’Azienda Ospedaliera di Perugia è stato realizzato il Progetto di Ricerca “La prevenzione del III millennio: la Biopsia Liquida”, finanziato dalla Lega Italiana per la Lotta contro i Tumori.

Purtroppo il tumore della mammella è diventato il tumore più frequente in Italia (52.800 nuovi casi per il 2018) superando gli altri due “big Killer” come il colon ed il polmone. Inoltre se teniamo conto dell’età della paziente, le percentuali d’incidenza tendono a modificarsi, infatti nel gruppo delle più giovani (<50 anni) il carcinoma della mammella costituisce il 41% dei tumori incidenti (fascia fuori screening). Noi siamo molto orgogliosi che a 5 anni la sopravvivenza raggiunge, nel nostro Paese, l’87% dei casi trattati, ma siamo molto preoccupati per un 30% che a 10-15 anni non supera la malattia. Secondo i dati dell’ISTAT (2014), sono 12.201 le donne morte di cancro della mammella in Italia in un anno. La LILT nel 2022 festeggerà i 100 anni della sua attività ed ha finanziato questo progetto per far si che ci si avvicini sempre più all’obiettivo finale: mortalità zero. 

La prima causa di morte nei pazienti oncologici è rappresentata dalla diffusione metastatica del tumore a partire dal sito primario. Comprendere i meccanismi che portano la cellula tumorale primitiva a trasformarsi in una cellula tumorale a capacità metastatica è fondamentale affinché si possa bloccare il processo di invasione tumorale e formazione delle metastasi a distanza.Il tumore è un moving target, cioè un bersaglio in continua evoluzione, tale da non poter essere effettivamente compreso nella sua complessità biologica dalle metodiche attualmente in uso. Infatti, ad oggi, la caratterizzazione bio-patologica del tumore è affidata ad esami istologici eseguiti su tessuti prelevati dal tumore stesso tramite biopsia o intervento chirurgico che però forniscono una fotografia istantanea della neoplasia, limitata al sito di prelievo e al momento del prelievo.

La biopsia liquida, basandosi sull’identificazione delle CTC (Cellule Tumorali Circolanti) nel sangue, sul sequenziamento del DNA tumorale estratto delle stesse CTC (ctcDNA) e sul DNA libero circolante (cell-free DNA, cfDNA), consentirebbe di conoscere in tempo reale il profilo genetico sia della lesione primaria che delle eventuali metastasi. Il potenziale della metodica è veramente importante perché il riscontro della CTC nella circolazione sanguigna delle pazienti anni prima dell’inizio della malattia metastatica, consentirebbe di utilizzare la biopsia liquida come una valida metodica di diagnosi precoce, di monitoraggio non invasivo della sensibilità o resistenza alla terapia e di permettere la selezione delle pazienti che necessitano di una precoce terapia sistemica. Le CTC sono estremamente rare: si considera circa una CTC per 10 6 cellule nucleate del sangue (PMN, linfociti etc.) nelle pazienti in stadio metastatico, rendendo impossibile la loro identificazione con le metodiche standard di imaging ad alta risoluzione. Quindi è stato necessario mettere a punto tecniche avanzate in grado di isolare e riconoscere con accuratezza e riproducibilità statistiche queste cellule tumorali occulte.

Un importante convegno si svolgerà venerdì 26 ottobre alle ore 10, presso l’Ospedale Silvestrini, dove si riuniranno i Centri Nazionali che aderiscono a  Biopsia Liquida. Ecco il programma della giornata

ore 10 Saluti: Dr. Roberto Noto, Direttore Generale LILT

ore 10:30 Risultati preliminari biopsia liquida Perugia: Prof. A. Rulli

ore 11 Isolamento ed enumerazione CTC: Prof. C. Antognelli

ore 11:30 Sequenziamento cfcDNA e ctcDNA: Dr.ssa V. Ludovini

ore 12 Trasporto campioni da Centri nazionali: Anna Togni

ore 12:30 “Isolation of polydisperse extracellular vesicles from blood”: Prof. A. Quattrone – Dr. V. D’Agostino

ore 13 Discussione con Centri Nazionali: Trento, Sassari, Bologna, Pisa, Roma La Sapienza, Roma Campus Biomedico, Campobasso, Benevento, Terni, Perugia (Città di Castello, Foligno).

ore 13:30   lunch


LO STUDIO
Dall’aprile del 2018, 40 pazienti con Early Breast Cancer (36 con neoplasia e 4 controlli sani) sono state sottoposte, prima dell’intervento chirurgico, a triplice prelievo ematico periferico: due
utilizzando provette specifiche (BD Vacutainer® K2 EDTA Tubes 7.5 mL) per l’isolamento, l’enumerazione delle CTC e l’estrazione del ctcDNA, il terzo prelievo è stato raccolto in altre provette (Qiagen, PAXgene Tube) per l’estrazione del cfDNA. Il ctcDNA e il cfDNA è stato sottoposto a successivo sequenziamento con tecnologia next generation sequencing (NGS) utilizzando la piattaforma ILLUMINA. I prelievi saranno ripetuti dopo la chirurgia, dopo la terapia adiuvante e a 12 mesi dalla data dell’intervento chirurgico.


CONSIDERAZIONI
Il DNA tumorale circolante (ctDNA) può essere distinto dal DNA libero circolante (cfDNA) in quanto il primo presenta le aberrazioni genetiche ed epigenetiche tumore-specifiche [51-52] . È bene considerare che il ctcDNA è rappresentato da DNA tumorale che viene rilasciato in circolo in seguito a necrosi od apoptosi delle stesse CTC e che quindi può anche essere ottenuto dopo lisi ed estrazione dalla stessa CTC isolata in laboratorio; mentre il cfDNA è costituito da materiale genetico presente nel torrente ematico ma che non è necessariamente di origine tumorale, potendo essere rilasciato anche da cellule non neoplastiche.

La presenza di DNA libero circolante nel plasma è ormai conoscenza assodata. Frammenti di DNA vengono costantemente riversati nel torrente ematico in seguito ai processi di morte cellulare, ma normalmente i livelli di cfDNA sono mantenuti molto bassi grazie all’azione di clearance esercitata da fegato, reni e milza. Nei pazienti oncologici, invece, la concentrazione di cfDNA è significativamente più alta in relazione al fatto che la massa tumorale, a differenza di un tessuto sano, è caratterizzata da un più alto turn-over cellulare e da un maggiore numero di eventi necrotici [51]. In media si calcola una concentrazione di cfDNA nel paziente con neoplasia solida 3-4 volte superiore alla norma: 0002/A avanzato 40,31 0019/A iniziale 0,05 I risultati preliminari del sequenziamento NGS, hanno mostrato che il ctcDNA, isolato dalle CTC, presenta alcune mutazioni nei geni ALK, NRAS, KRAS, che si ritrovano anche nel cfDNA. La quota di cfDNA riversato nel circolo ematico è strettamente dipendente dalla sede, dal diametro, dal tipo di vascolarizzazione del tumore, questo determina un’importante variabilità interindividuale nei pazienti oncologici [53].

Già dai primi studi è emerso che esiste una correlazione di tipo quantitativo tra la concentrazione di cfDNA e la massa tumorale, con corrispettive oscillazioni dei livelli di cfDNA in relazione alla risposta o meno alla terapia [53]. Gli studi condotti da Allard, Cristofanilli, De Bono e Cohen [56-63] hanno dimostrato che il numero delle CTC è da considerarsi come fattore prognostico indipendente in termini di sopravvivenza libera da progressione (PFS) e sopravvivenza globale (OS). Dall’analisi multivariata (57, 64) che comprende diametro tumorale, stato linfonodale, grading istologico e caratterizzazione bio- patologica del tumore, risulta che il numero delle CTC è da considerarsi un fattore prognostico indipendente per la sopravvivenza libera da malattia, la sopravvivenza libera da recidiva di malattia, la sopravvivenza cancro-specifica e la sopravvivenza globale.


Lo studio ha inoltre messo in evidenza che il ruolo prognostico delle CTC varia a seconda del sottogruppo di pazienti che si va a valutare. Infatti per le pazienti definite a basso rischio, perché affette da neoplasia diagnosticata in stadio molto precoce (T1N0), il ruolo delle CTC sulla prognosi è meno rilevante e il trattamento di successo è indipendente rispetto al numero delle CTC presenti in circolo. Tutt’altro è il ruolo delle CTC nelle pazienti considerate ad alto rischio con neoplasia in stadio più avanzato, dove l’enumerazione delle CTC potrebbe essere dirimente nelle scelte terapeutiche. La definizione di un cut-off numerico di CTC che correli con il loro ruolo prognostico non è stato ancora definito con certezza per le pazienti con Early Breast Cancer. Infatti se per le pazienti con neoplasia in stadio metastatico, gli studi precedenti avevano individuato il numero di 5 CTC come cut-off statisticamente rilevante [64] , per le pazienti in stadio precoce sembrerebbe che già il riscontro di almeno 1 CTC possa condizionarne l’outcome. Noi, utilizzando una strumentazione molto più sensibile (Isoflux) che potrebbe anche isolare le cellule che hanno subito la trasformazione epitelio–mesenchimale (Epithelial–mesenchymal transition, EMT). Abbiamo per adesso, considerato un cut off di 3 CTC.

Le CTC sono state definite come markers “predittori silenziosi di metastasi”, a significare che il riscontro di CTC nel sangue di un paziente oncologico vada ad identificare indiscutibilmente un
processo di metastatizzazione già in atto, prima ancora che qualsiasi altra metodica di imaging, oggi disponibile, sia in grado di identificare la lesione neoplastica clonale a distanza.Inoltre la mancata negativizzazione del numero delle CTC dopo chirurgia può significare che sono presenti focolai micrometastatici a distanza. Al contrario la scomparsa di CTC dopo l’intervento
chirurgico può significare che la malattia sia stata probabilmente debellata. L’analisi mediante sequanziamento NGS del cfDNA e del ctcDNA sembrerebbe ad oggi utile per comprendere l’eterogeneità e complessità del tumore dal punto di vista genetico.

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